血小板抗体检测相关知识
血小板具有复杂的抗原系统，包括与其它组织或细胞所共有的抗原，如ABO血型系统抗原和人类白细胞抗原（HLA）；血小板特异性抗原（HPA）；与单核/巨噬细胞及有核红细胞共有的GPⅣ/CD36抗原等。妊娠、输血、器官移植等均可诱导机体产生血小板抗体，包括HLA抗体、HPA抗体和CD36抗体等。这些抗体可以引起免疫性血小板输注无效（PTR）、胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）、非溶血性发热反应（NHTR）、输血后紫癜（PTP）等。
检测原理是基于抗原/抗体反应的固相凝集技术。血小板的单层细胞层通过离心固定在包被有血小板特异性鼠单克隆抗体的微孔内表面。将患者血清和LISS（低离子强溶液）加入相应的微孔中孵育，使患者血清中抗体与固定的血小板血清中的抗体与固定的血小板单细胞层结合。孵育结束后，洗去未结合的血清成分。加入鼠单克隆抗人IgG和人IgG致敏红细胞（MSAPAT指示红细胞）后，通过离心微孔板的方法检测血小板结合抗体。抗人IgG和MASPAT指示红细胞结合到血小板单细胞层上的IgG抗体上，则显示阳性反应。因此，阳性反应的特点是MASPAT指示红细胞平铺在反应孔底部表面，而阴性反应史MASPAT指示红细胞聚集在孔底部中央。
红细胞抗体已经成为临床输血前免疫学检测的常规项目，而输血前血小板抗体检测并未得到临床充分重视。目前，血小板输注的策略主要采用随机输注方式，反复输血及多次妊娠者容易产生血小板抗体，引起PTR、FNAIT等疾病，以及NHTR、PTP等输血不良反应。为保障临床输血安全和疗效，预防PTR和输血不良反应，节约血液资源，诊断血小板抗体相关免疫性疾病，现形成血小板抗体检测专家共识，内容如下。
1血小板抗体检测的临床意义
1.1免疫性血小板输注无效（PTR）诊断：
血小板抗体是免疫性PTR的主要原因。一般患者输注血小板后血小板抗体的阳性率为8.2%～60.0%，肿瘤患者和干细胞移植患者血小板抗体阳性率为12.6%～66.0%[8-10]，这些抗体是导致免疫性PTR的主要因素。对患者进行血小板抗体筛查和鉴定，可以诊断免疫性PTR。对血小板抗体阳性患者输注血小板交叉配合的血小板，可有效预防免疫性PTR。
1.2HLA抗体导致NHTR诊断：
NHTR在输血反应中占比最大，输注红细胞的NHTR的发生率约为0.08%～6.0%，输注血小板NHTR的发生率可高达20.3%～70.0%。NHTR主要由HLA抗体引起。HLA抗体引起的NHTR约占总输血反应的14.6%，是引起血小板配血不合和PTR的主要原因。输血前对患者常规检测血小板抗体筛查和鉴定，可以诊断HLA抗体引起的NHTR。同时，为血小板抗体阳性患者提供HLA配型相合的血小板，输注白细胞去除的红细胞、血小板，不但可以预防PTR，而且可预防NHTR。
1.3胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）诊断：
FNAIT是由于胎儿与其母体血小板抗原不相容，来自母体的IgG血小板抗体作用于胎儿血小板引起血小板破坏的同种免疫性疾病，其主要风险是胎儿宫内死亡或颅内出血，是新生儿严重血小板减少症的常见原因，发病率为0.05%-0.15%，第1胎就可以发病。患儿母亲存在针对胎儿血小板抗原的抗体是FNAIT的实验室诊断依据。通过孕晚期产前规检测母体血清或血浆中血小板抗体及效价，可诊断FNAIT并及时给出治疗建议。
1.4输血后紫癜（PTP）诊断：
PTP是一种少见的血小板输注后不良反应，在输注血小板制品3～12天后，突然出现严重的血小板减少，临床上可出现皮肤淤点、淤斑和粘膜出血等症状，主要发生于有输血史或孕产史的患者，输血患者的发生率是0.%～0.%。血小板抗体筛查和鉴定可诊断PTP，通过血小板配型为患者输注配合的血小板可预防和治疗PTP。
1.5其他与血小板抗体相关疾病的辅助诊断
1.5.1原因不明性反复流产的辅助诊断：
原因不明性反复流产患者中HLA抗体与活产率降低相关。孕妇中HLA抗体阳性率为3.7%～5.6%，经产妇及有早期流产史者的HLA阳性率可达11.4%25.0%。HPA抗体也可致流产，孕妇IgG类HPA抗体进入HPA不相合胎儿体内不仅可导致胎儿血小板加速破坏，其中抗-GPIbα还可导致胎盘发生广泛的纤维蛋白沉积，并严重损害胎盘功能和血液灌注，激活血小板，诱导磷脂酰丝氨酸表达，导致血栓形成，进而导致胎儿自然流产。抗-3整合素影响胎盘和胎儿血管生成，导致胎儿颅内出血。因此，对于有反复流产史的妇女，进行HLA和HPA抗体筛查和鉴定，有助于查明流产原因和治疗。
1.5.2原发性免疫性血小板减少性紫癜（ITP）的辅助诊断：
原发性免疫性血小板减少性紫癜（ITP）的发病机制主要是血小板抗体介导了血小板破坏及血小减少。51.7%～63.5%免疫性血小板减少性疾病患者血小板抗体为阳性，而普通患者血小板抗体阳性率仅为4.9%～15.2%。检测患者自身血小板抗体及效价，可辅助诊断ITP。
1.5.3继发性免疫性血小板减少性紫癜（SITP）的辅助诊断：
继发性免疫性血小板减少性紫癜（SITP）是一类与免疫系统紊乱相关的自身免疫性疾病，可由于持续感染、淋巴组织增生、骨髓增生性疾病、妊娠、免疫缺陷和自身免疫性疾病引起；也可以是药物诱导的自身免疫性疾病，目前已知有百余种药物可免疫性介导血小板破坏，常见的药物有：青霉素、头孢菌素、红霉素、万古霉素、磺胺类、GPⅡb/Ⅲa拮抗剂等药物可诱导机体产生药物依赖性和非药物依赖性血小板抗体，SITP是这些药物治疗的并发症。非药物依赖性血小板抗体与其他血小板自身抗体在血清学上难以区分。药物诱导的血小板抗体通常在停药后很快消失。检测血小板抗体可为SITP的诊断和治疗提供依据。
2血小板抗体检测对象为保障患者输血疗效与安全
辅助诊断血小板免疫性相关疾病，经中国医师协会输血科医师分会和中华医学会临床输血学分会部分输血专家团队以及与相关临床科室专家认真研讨，一致认为应对以下患者进行血小板抗体检测：
2.1血小板输注患者；
2.2NHTR患者；
2.3有输血史、妊娠史、器官移植、血液病、自身免疫性疾病、肿瘤等需要输血患者；
2.4ITP、SITP、PTP患者；
2.5不明原因性反复流产患者；
2.6可疑FNAIT妊娠患者；
2.7血小板计数降低原因不明患者；
2.8其它输血不良反应（如输血相关急性肺损伤等）的原因调查患者。
3血小板抗体检测内容
3.1血小板抗体筛查。包括HLA抗体和HPA抗体。适用于血小板输注，白血病，再生障碍性贫血，溶血性贫血，肿瘤，骨髓纤维化，骨髓异常综合征等患者及孕妇，以调查患者血小板减少或流产是否由免疫因素导致。
3.2血小板交叉配血。将患者血清与数个ABO同型的单人份血小板分别配型，从中筛选反应阴性或其中反应最弱的血小板进行输注，减少血小板输注无效的发生。
3.3血小板自身抗体检测。适用于自身免疫性血小板减少症（ITP），系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病患者血清/血浆中血小板自身游离抗体和已致敏血小板表面的结合抗体。
4血小板抗体试剂盒组成
4.1微孔板：一个微孔板包含8x12条共96个u型孔。所有u型孔均包被了血小板特异性单克隆抗体。MASPAT微孔板密封在装有干燥剂的真空小塑料袋中。开封后，需2-8℃保存，开封后有效期为4周。
4.2低离子强度溶液10ml
4.3阳性质控1ml：包含血小板特异性抗体
4.4阴性质控品1ml：不包含血小板特异性抗体
4.5抗IgG6ml：对人IgG(IgG1,IgG2,IgG3)有特异性的鼠单克隆抗体
仪器设备：板式离心机，震荡孵育器
5血小板抗体检测样本要求
5.1标本要求：采集血清或枸盐酸钠、EDTA抗凝的血浆。无溶血、脂血和*疸等。
5.2标本量：全血5mL左右。
5.3将血液标本按rcf离心10分钟获得血清标本。若不能马上进行检测，血清标本应保存在-18℃。
5.4血小板悬液的浓度不得低于50x/L。
6血小板抗体检测具体操作流程
6.1血小板抗体检测
（1）按需从小袋中取出微孔板条。未用的微孔板条可以保存在装有干燥剂的小袋中。
（2）用塑料移液管在每个孔中（患者血清孔、MASPAT阳性质控孔、MASPAT阴性质控孔）加入一滴筛选血小板抗原。建议每条微孔板条都进行阳性质控和阴性质控试验。
（3）50rcf离心5分钟，使血小板固定到位孔板表面（不间断离心）
（4）用ul的PBS/Tween0.05%手工洗板三次，去掉未结合血小板，用多道移液枪逐滴加入洗液。每次洗后，慢慢倾倒并轻轻拍打去掉PBS/Tween
（5）每孔中加入2滴MASPATLISS。LISS液是紫色的。
（6）在适当的孔中加入1滴MASPAT阳性质控或阴性质控。阳性质控检测血小板抗体是否充足。
（7）在其他孔中加入1滴患者血清。
（8）将微孔板在37℃孵育30分钟（孵育过程密封微孔板）
（9）按照步骤4清洗微孔板5次
（10）清洗后立即在为孔板中加入1滴MASPAT抗IgG试剂。
（11）每孔加入1滴MASPAT指示红细胞，轻轻震荡。
（12）将微孔板rcf离心5分钟（不间断离心）
（13）读取结果
（14）如果清洗步骤是通过自动化设备进行的，请确认清洗是否有效
6.2血小板交叉配血
（1）制备与ABO同型的供者血小板悬液：有效期内机采血小板浓缩液（PC，用时需用生理盐水10倍稀释）或采血当天8h内EDTA抗凝全血经g离心10min，取上层富血小板血浆。
（2）按需从小袋中取出微孔板条。未用的微孔板条可以保存在装有干燥剂的小袋中。
（3）用塑料移液管在每个孔中（患者血清孔、MASPAT阳性质控孔、MASPAT阴性质控孔）加入一滴供者PRP或PC。建议每条微孔板条都进行阳性质控和阴性质控试验。
（4）50rcf离心5分钟，使血小板固定到位孔板表面（不间断离心）
（5）用ul的PBS/Tween0.05%手工洗板三次，去掉未结合血小板，用多道移液枪逐滴加入洗液。每次洗后，慢慢倾倒并轻轻拍打去掉PBS/Tween。
（6）每孔中加入2滴MASPATLISS。LISS液是紫色的。
（7）在适当的孔中加入1滴MASPAT阳性质控或阴性质控。阳性质控检测血小板抗体是否充足。
（8）在其他孔中加入1滴患者血清。
（9）将微孔板在37℃孵育30分钟（孵育过程密封微孔板）
（10）按照步骤（5）方法，用ul的PBS/Tween洗板5次
（11）清洗后立即在为孔板中加入1滴MASPAT抗IgG试剂。
（12）每孔加入1滴MASPAT指示红细胞，轻轻震荡。
（13）将微孔板rcf离心5分钟（不间断离心）
（14）目视结果或使用读数仪判读结果
如果清洗步骤是通过自动化设备进行的，请确认清洗是否有效
6.3血小板自身抗体检测
（1）制备患者血小板悬液：将采血当天8h内EDTA抗凝全血经g离心10min，取上层富血小板血浆。血小板悬液的浓度不得低于50x/L。
（2）自身结合抗体的检测
A.按需从小袋中取出微孔板条，标记患者和对照孔。未使用的微孔板条保存在装有干燥剂的小袋中。
B.患者孔加入1滴患者血小板悬液，对照孔中加入1滴健康血小板悬液，轻轻摇晃反应板10s
C.50rcf离心5分钟，使血小板固定到位孔板表面（不间断离心）
D.用ul的PBS/Tween0.%洗板三次，去除未结合血小板。用多道移液枪驻地加入洗液。每次清洗后，慢慢倾倒并轻轻拍打去掉PBS/Tween。
E.立即加入1滴MASPAT抗IgG试剂
F.每孔加入1滴MASPAT指示红细胞，轻轻震荡。
G.将微孔rcf离心5分钟（不间断离心）
H.目视结果或使用读数仪判读结果
如果清洗步骤是通过自动化设备进行的，请确认清洗是否有效
（3）自身游离抗体检测
A.按需从小袋中取出微孔板条，标记患者和对照孔。未使用的微孔板条保存在装有干燥剂的小袋中。
B.患者孔加入1滴患者血小板悬液，对照孔中加入1滴健康血小板悬液，轻轻摇晃反应板10s
C.50rcf离心5分钟，使血小板固定到位孔板表面（不间断离心）
D.用ul的PBS/Tween0.%洗板三次，去除未结合血小板。用多道移液枪驻地加入洗液。每次清洗后，慢慢倾倒并轻轻拍打去掉PBS/Tween。
E.每孔中加入2滴MASPATLISS。LISS液是紫色的。
F.在适当的孔中加入1滴MASPAT阳性质控或阴性质控。阳性质控检测血小板抗体是否充足.
G.在其他孔中加入1滴患者血清。
H.将微孔板在37℃孵育30分钟（孵育过程密封微孔板）
I.按照步骤D方法，用ul的PBS/Tween洗板5次
J.清洗后立即在为孔板中加入1滴MASPAT抗IgG试剂。
K.每孔加入1滴MASPAT指示红细胞，轻轻震荡。
L.将微孔板rcf离心5分钟（不间断离心）
M.目视结果或使用读数仪判读结果
如果清洗步骤是通过自动化设备进行的，请确认清洗是否有效
7血小板抗体检测结果判定
7.1阳性或弱阳性反应（微孔底部形成一层红细胞）表明血清中存在血小板抗体；
7.2阴性反应（红细胞在微孔底部形成纽扣状）表明血清中不存在血小板抗体。
7.3对照：按照试剂说明书要求设置阴阳性对照，一般应阳性对照：阳性；阴性对照：阴性。
8血小板抗体检测质量控制
8.1使用国家药品监督管理部门批准的试剂和相应的质控品。
8.2有条件应参加室间质评。
8.3每次检测均应按照试剂盒说明书设置阳性对照和阴性对照，阳性对照血清结果呈阳性，阴性对照血清呈阴性，实验结果认定为有效。
本期编辑：杨慧敏
市一院
输血科
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